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Exosome外泌體是細胞外泌囊泡中體積較小的一種。近幾年，人們發現這種微小膜泡中含有細胞特異的蛋白、脂質和核酸，能作為信號分子傳遞給其他細胞從而改變其他細胞的功能。外泌體在很多生理病理起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等。不同的細胞分泌的外泌體具有不同的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物，也可用于靶向藥物的定向傳輸。
樣本準備：外泌體分離需要多少起始材料？
成功分離外泌體所需的起始材料，取決于你所研究的體液、所選擇的分離方法以及將進行的下游分析。外泌體的濃度隨體液類型和疾病狀態而異。最好對目標體液和疾病所涉及的外泌體濃度進行評估。知道樣品所含外泌體的濃度之后，你還需要了解自己所選外泌體分離方法的效率，你可以采用標準化外泌體樣品或微球進行計算， 然后可以反推計算達到所需的總體積，其中考慮到樣品損耗和外泌體裂解引起的外泌體損耗。成功分離外泌體后，你希望確保所選下游分析具備足夠的起始材料（DNA、RNA、蛋白質）。現有方案的初始體積范圍最低為3～4mL，最高為50mL。
制備方法：用什么方法分離外泌體，以及如何表征這種混合的外泌體群體？
過濾后采用低轉速除去完整細胞、細胞碎片和大聚集體。使用轉頭速度超過100,000×g 的貝克曼超速離心機高速離心處理2小時以上，可以沉淀、濃縮外泌體。
如需對外泌體群體進一步純化分離，建議以轉速為100,000×g的5～40% 碘克沙醇非連續性密度梯度離心法處理18小時以上。分離外泌體并確認其回收率之后，在臺式超速離心機中以超過100,000×g的轉速處理外泌體1.5～2小時，即可令外泌體沉淀。外泌體群體一般通過光散射法、二代基因測序法及蛋白質印跡法進行表征。
儲備條件：樣品儲存條件（包括從不同來源分離出來的外泌體溫度），以及外泌體分離前生物體液和細胞培養樣品的儲存條件？
使用的純化外泌體儲存在 -20℃ 條件下，而長期儲存的溫度則為 -80℃。我們尚未發現不同外泌體來源在儲存條件影響方面存在任何差異。
大多數生物體液（尿液、精液、唾液等）可以在分離外泌體之前存放于 -80℃ 條件下。對于細胞培養，大多數細胞系在37℃、5% CO2條件下儲存。
內含物表征：如果我們進行以下操作，總共需要花多長時間？
1、從細胞培養基和血漿中提取外泌體
首先是3個不同的沉淀步驟，共需2個小時，接著進行隔夜密度梯度離心步驟，目的是分離出細胞培養基或血漿中的外泌體。
2、RNA分離、NGS和分析
用Biomek 4000分離RNA約花費3小時，接著是特定RNA類型的富集（供NGS使用）。NGS和分析高度取決于所采用的系統和所進行的分析類型。
外泌體分離純化的金標準
超速離心分離是從生物體液和細胞培養樣品中分離純化外泌體的黃金標準，可以準確地重復獲取外泌體，同時******限度減少蛋白質聚集體和其他膜粒子的共純化。
Exosome的離心純化標準流程
差速離心富集法
密度梯度離心法
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