慢病毒屬于逆轉錄病毒科,包括8種能夠感染人和脊椎動物的病毒,原發感染的細胞以淋巴細胞和巨噬細胞為主,感染個體最終發病。慢病毒感染患者早期很難觀察,大多經歷長達數年的潛伏期,之后緩慢發病,因此稱為慢病毒(Lentivirus)。慢病毒通常與免疫系統和中樞神經系統的慢性疾病有關,如人類免疫缺陷病毒(HIV)會導致艾滋病。
慢病毒載體是以慢病毒基因組為基礎,對其自身元件進行改造而發展起來的一類能夠攜帶外源基因的病毒載體。根據來源,主要有HIV-1、HIV-2、SIV等不同類型,其中HIV-1型載體系統應用最為廣泛。
與其他病毒相比,慢病毒有其獨特的優點:
宿主更廣泛
對于分裂和非分裂細胞均具有感染能力。對于一些較難轉染的細胞,如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等,能大大提高目的基因轉導效率。
穩定表達
慢病毒基因組可整合于宿主基因組,因此可以長時間、穩定表達外源基因。
可攜帶大約5kb或更長的外源基因片段
基于慢病毒載體的優點,其被廣泛應用于RNAi、基因治療以及轉基因動物等研究中。體外構建能夠表達siRNA的慢病毒載體,然后進行細胞轉染,使其在細胞內轉錄siRNA,可發揮長期阻斷基因表達的作用。同時,以慢病毒作為基因載體的多種基因療法已在國內外開展臨床研究,效果非常理想,在基因治療中擁有廣闊的應用前景。
當使用慢病毒載體感染細胞時,通常需要濃縮病毒顆粒以獲得高滴度,特別是需要感染大量細胞或者用于某些對轉導具有抵抗力的細胞系時。離心是濃縮病毒的一種簡單有效的方法,這里我們介紹兩種常用的濃縮慢病毒載體的方法。
PEG濃縮法
聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一種無電荷的線性分子結構的多糖,為乙二醇的聚合物,具有高親水性,在溶液中會吸收大量水分,減少病毒之間的距離,使病毒聚合在一起,提高病毒的相對濃度,達到沉淀濃縮的目的。
基本流程:
收集病毒上清液,使用0.45 μm濾膜過濾,除去細胞及細胞碎片。
將上清液與40% PEG溶液混合(可使用PEG8000、4000或6000),最終PEG濃度為10%。冰上放置3到6小時。
放于Avanti J-15R離心機中,2000 ×g 離心30 min。
去掉上清,使用1/20原始樣品體積的PBS緩沖液對離心后形成的沉淀進行重懸。
為了進一步濃縮,將重懸后的病毒樣品轉移到已預先消毒的超速離心管(Ultra-Clear Tube #344058)中,并使用PBS緩沖液進行配平。
(注:可選用無菌無酶離心管 #C14292)
按次序將超速離心管放置于SW 32 Ti的吊桶中。
將裝有病毒樣品的SW 32 Ti轉頭放置于Optima XPN-100超速離心機中,100,000 ×g(24,500 rpm)離心90 min。
直接傾倒或使用移液器小心去除上清,注意不要將病毒顆粒倒出。
使用PBS或其他病毒存儲液重懸沉淀,并將所有管中的樣品集中在一個離心管中。
集中的病毒樣品分裝后,-80℃保存備用。
蔗糖墊液離心法
為更好地保持病毒顆粒形態與結構的完整性,超速離心濃縮時經常在管底加入蔗糖墊液,使病毒樣品在到達管底時沉降減速或不形成沉淀。
基本流程:
收集病毒上清液,使用0.45 μm濾膜過濾,除去細胞及細胞碎片。
在已預先滅菌的超速離心管(Ultra-Clear Tube #344058)底部小心加入3-5 ml 20%蔗糖墊液。
(注:可選用無菌無酶離心管 #C14292)
小心地將病毒上清液加至離心管中蔗糖墊液上。
將超速離心管配平后小心放入吊桶中。
將裝有病毒樣品的SW 32 Ti轉頭放置于Optima XPN-100超速離心機中,4℃,125,000 ×g離心90 min。
直接傾倒或使用移液器小心去除上清,注意不要將病毒顆粒倒出。
加入PBS或其他病毒存儲液重懸沉淀,可選擇在4℃下溶解2小時,每20分鐘輕輕震蕩。
對離心得到的病毒樣品進行分裝,-80℃保存備用。
點擊了解
“OPTIMA XPN 系列超速離心機”
Optima XPN-100
最高轉速:100,000 rpm
******相對離心力:802,400 ×g
15寸液晶顯示屏
內置離心專家軟件
SW 32 Ti 水平轉頭
最高轉速:32,000 rpm
******相對離心力:175,000 ×g
******容量:6 × 38.5 mL
安全、高效的插入式轉頭
參考文獻:
1. https://baike.baidu.com/item/慢病毒
2.https://media.beckman.com/-/media/pdf-assets/application-notes/centrifuge-application-note-lentiviral-vector-preparation-ultra.pdf
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